OBJECTIUS

1. Preparar un medi de cultiu sòlid per a impregnar diverses plaques de Petri.
2. Cultivar i descriure comunitats microbianes present a diferents superfícies d’àmbit quotidià.
3. Descriure l’evolució en el temps de la comunitat microbiana cultivada.

MATERIAL

– Forn de cultiu
– Olla a pressió o autoclau
– 2 plaques de Petri
– Palets encotonats de les oïdes estèrils
– Cremador de flama
– Nansa de cultiu
– Cub de concentrat alimentari deshidratat de brou de carn
– 2 làmines de gelatina neutra
– Aigua destil·lada
– Matràs en pyrex
– Retolador permanent

FONAMENTS

Els bacteris són organismes unicel·lulars procariotes del Regne Monera, de dimensions microscòpiques (0,001 – 0,1 mm), que es reprodueixen per bipartició. La majoria són heteròtrofs, tot i que hi ha que són autòtrofs (cianobacteris). Van aparèixer a la Terra fa com a mínim 3800 milions d’anys i es troben en tots els hàbitats terrestres i aquàtics, essent els organismes més abundants del planeta, i fins i tot es troben en condicions fisicoquímiques extremes (extremòfils). La quantitat de bacteris per unitat de superfície és molt elevada (per exemple, 40 milions de bacteris en un gram de terra o un milió de bacteris en un mil·lilitre d’aigua dolça. En el nostre cos hi ha 10 vegades més cèl·lules bacterianes que cèl·lules del nostre propi cos!).

Els bacteris presenten una àmplia varietat de mides i formes, tot i que es poden distingir 3 tipus fonamentals de formes: els cocs (de forma esfèrica), els bacils (en forma de bastonet) i els de formes helicoïdals (vibrió (en forma de coma ortogràfica), espiril (en forma de llevataps) o espiroqueta (helicoïdal flexible)). D’altra part, es poden trobar aïllats o com a agrupaments cel·lulars (diplococ (cocs de dos en dos), estreptococ (cocs en cadenes), estafilococs (agrupacions irregulars), etc.).

Al laboratori és possible reproduir el medi de cultiu necessari per al creixement de colònies bacterianes utilitzant substàncies nutritives artificials i controlant les condicions físiques com la humitat o la temperatura. D’aquesta manera es pot observar la diversitat bacteriana d’una determinada mostra (com per exemple la que viu sobre la nostra pell o sobre la pantalla del mòbil), així com analitzar el creixement de les colònies bacterianes i possibles interaccions entre elles. També és possible interpretar l’evolució del cultiu en termes de successió ecològica des de la colonització d’un medi estèril fins a l’assoliment del clímax o equilibri.

La preparació d’un medi de cultiu nutritiu genèric permet el creixement de colònies bacterianes que no tenen requeriments especials (no creixeran bacteris que necessitin condicions anaeròbiques o altres condicions fisicoquímiques o nutritives particulars). Els bacteris que són sembrats en el medi de cultiu començaran a reproduir-se per bipartició, de manera que als pocs dies o a les poques hores es formaran colònies visibles a simple vista formades per milions de clons. La morfologia i color d’aquestes colònies permet distingir diferents espècies de bacteris:

Cal tenir en compte que en els cultius també és possible que creixin fongs (llevats i floridures), que haureu de saber distingir. Els llevats són fongs unicel·lulars eucariotes. Les floridures, en canvi, són fongs pluricel·lulars eucariotes que formen un miceli constituït per filaments (hifes). Aquestes hifes poden desenvolupar esporangis plens d’espores molt fàcilment reconeixibles.

Condicions de treball estèril

Amb l’objectiu de minimitzar la contaminació de les mostres amb microorganismes no considerats a l’estudi, és necessari esterilitzar l’instrumental i el medi de cultiu amb un autoclau i manipular-lo posteriorment en condicions de treball estèril.

L’autoclau és una olla a pressió dins de la qual s’aconsegueix una temperatura de 120ºC en una atmosfera humida de vapor d’aigua. 10 – 20 minuts en aquestes condicions són generalment suficients per destruir els bacteris, els fongs i altres microorganismes.

Per aconseguir un treball en condicions d’asèpsia cal disposar d’un espai de treball perfectament net i procedir de la manera següent:

1) Tancar la porta i les finestres del laboratori.

2) Rentar-se les mans i els braços amb aigua i sabó de manera exhaustiva i, sense assecar-se amb paper, impregnar-se amb alcohol, fregar-se’l i deixar assecar a l’aire. Mentrestant, fer-se una mascareta de paper de cel·lulosa que recobreixi el nas i la boca i s’ajusti sobre les orelles.

3) Amb la taula de treball prèviament neta amb aigua i sabó, tornar a netejar amb alcohol i paper de cel·lulosa i deixar assecar a l’aire. Seure a lloc i, des d’aquest moment, evitar tocar la taula, moure’s o parlar.

4) El foc és el millor sistema d’esterilització. És per això que es treballarà amb una flama. Cal manipular tots els recipients i instruments a l’interior de l’àrea estèril entorn de la flama i amb les obertures dirigides cap a la flama.

5) Esterilitzar l’instrumental del sembra (agulles emmanegades, per exemple) impregnant-lo en alcohol i passant-lo a la flama momentàniament (cal ser prudent i actuar amb cura per a evitar u incendi).

6) Obrir els recipients i les plaques de Petri el mínim de temps possible i només l’obertura necessària.

PROTOCOL

Preparació d’un medi de cultiu sòlid casolà

Els cultius en plaques de Petri acostumen a fer-se amb medis sòlids a base d’agar-agar (un espessidor natural d’origen algal) juntament amb un conjunt de substàncies nutritives, que poden ser genèriques o selectives amb l’objectiu de cultivar qualsevol bacteri o grups determinats de bacteris, respectivament. Aquí utilitzarem un cub de concentrat alimentari deshidratat de brou de carn com a font de nutrients i gelatina neutra com a espessidor.

1) Dissoleu ½ cub de concentrat alimentari en 200 ml d’aigua bullint en un vas de precipitats fins que la mescla esdevingui homogènia. Mentrestant, hidrateu en un altre vas de precipitats dues làmines de gelatina amb aigua freda fins que s’estovi.

2) Filtreu el brou amb paper de filtre en un vas de precipitats i deixeu reposar i refredar.

3) Quan el brou assoleixi una temperatura aproximada de 50ºC retireu el greix de la superfície amb una espàtula o amb paper de cel·lulosa i afegiu les dues làmines de gelatina. Mescleu amb la vareta de vidre fins a homogeneïtzar la mescla i filtreu en un matràs erlenmeyer.

4) Tapeu la boca de l’erlenmeyer amb paper d’alumini i poseu el recipient a l’interior de l’autoclau amb una base d’aigua i una gradeta per mantenir el recipient elevat. Afegiu al costat les plaques de Petri ben netes, seques i tancades. Tanqueu l’autoclau i porteu a ebullició (10 minuts des de l’emissió de vapor per la vàlvula a la posició de màxima pressió). Posteriorment deixeu que es refredi i disminueixi la pressió interna abans d’obrir l’autoclau.

5) Amb el brou encara calent (uns 50ºC), ompliu les plaques de Petri en condicions de treball estèril i tapeu-les immediatament. Fixeu els dos vidres amb cinta de carrosser i deixeu reposar fins que la gelatina qualli.

6) Conserveu les plaques de Petri a la nevera, invertides i ben tapades.

Recol·lecció de mostres i sembra

7) Decidiu on voleu recollir les mostres (teclats d’ordinador, pantalles tàctils de mòbil, poms de les portes, la palma de les mans, o senzillament deixar a l’aire la placa de Petri durant una estona per tal de cultivar els microorganismes que porta el vent).

8) Determineu els objectius científics del vostre treball. Pot ser senzillament observar els microorganismes presents en diferents mostres o comparar l’abans i el després d’haver netejat les superfícies. En qualsevol dels casos, caldrà mantenir una placa de Petri sense obrir com a control de l’experimentació. És útil formular hipòtesis senzilles per a poder identificar els objectius concrets de la vostra experimentació.

Siguin quins siguin els objectius inicials del treball, l’objectiu final ha de ser estudiar l’evolució en el temps del cultiu i les interaccions que es puguin produir entre les diferents colònies.

9) Recol·lecteu les mostres segons una metodologia detallada i preestablerta a fi de no deixar marge a factors que no estiguin controlats. Per a la recolecció podeu utilitzar palets encotonats estèrils. Si no disposeu de palets encotonats, podeu utilitzar sembradors passats prèviament per la flama.

10) Sembreu les mostres sobre la superfície gelatinosa de les preparacions pel mètode d’estria simple o seqüencial.

La sembra simple consisteix en fregar suaument la superfície de la preparació amb una nansa de cultiu en la que s’hagi inoculat la mostra, o directament amb el palet encotonat, fent un ziga-zaga des d’un extrem de la placa de Petri fins a l’altre, amb un progressiu augment de la separació entre anada i tornada:

La sembra seqüencial és similar, però s’inocula la mostra sobre la nansa una única vegada, i als següents ziga-zagues a un quart de volta de la placa de Petri s’arrossega parcialment la mostra directament des del ziga-zaga anterior (entre cultiu i cultiu es passa la nansa per la flama). D’aquesta manera s’aconsegueix aïllar bacteris a l’última seqüència perquè les colònies creixin separades i es puguin estudiar millor:

En el cas de voler cultivar els microorganismes que transporta l’aire, senzillament deixeu oberta una placa de Petri durant una estona i després torneu a tancar.

11) Etiqueteu convenientment les plaques de Petri amb el retolador permanent (mostra, data i codi). El codi de cada placa ha de ser únic, i ha de servir per a identificar la mostra en totes les observacions i anotacions que prengueu.

Cultiu

12) Coloqueu les mostres a l’estufa de cultiu a 30ºC durant 24 a 36 hores, inicialment, i posteriorment fins a la finalització de la vostra recerca. No obriu les plaques de Petri excepte en el cas que sigui absolutament necessari, i sempre en ambient estèril (a l’entorn de la flama).

ACTIVITATS

13) Confeccioneu un pòster científic que comuniqui gràficament i de manera clara la vostra investigació. En el pòster s’han de fer constar les dades següents:

– Títol de la investigació
– Autors
– Objectius científics de la recerca
– Metodologia utilitzada
– Resultats
– Conclusions
– Bibliografia
– Agraïments

El títol ha de ser precís i concís. Ha d’informar convenientment de la recerca. Tot mot ha de ser necessari i imprescindible.

Els objectius han de ser clar i innequívocs. Pot ser convenient definir uns objectius generals i uns altres d’específics. Exposeu-los esquemàticament, enumerant-los.

La metodologia ha de ser molt clara, especificant cadascun dels passos. Heu d’evitar que en la metodologia seguida incorporeu variables que no controleu.

Els resultats han de ser clars, sempre en relació als objectius previstos. Presenteu-los de forma gràfica i numèrica. Si cal, tracteu les dades estadísticament.

Les conclusions no són MAI una opinió personal. Han de ser la resposta als objectius. Si hi ha 3 objectius, han d’haver 3 conclusions!

Comparteix