LA TÈCNICA DE LA PCR
La clonació de gens i, en general d’ADN ha estat possible gràcies a una tècnica inventada al 1980, la PCR ( acrònim anglès de polymerase chain reaction) per Kary Mullis que li va suposar el premi Nobel de Química al 1993. La PCR va ser patentada al 1987 per la companyia Cetus per a la qual treballava Mullis.
La PCR és un mètode ràpid i versàtil d’ampliació in vitro de seqüències d’ADN o d’ARN. Permet ampliar una petita part d’ADN, anomenat ADN diana, d’una mostra d’ADN. Això permet obtenir una gran quantitat de copies d’un gen o d’un fragment d’ADN que ens interessi estudiar o que ens interessi clonar.
La tècnica es basa en la desnaturalització/hibridació de l’ADN. La desnaturalització consisteix en el trencament dels ponts d’hidrogen que estabilitzen les dues cadenes d’ADN que formen la doble hèlix, quan s’escalfa la molècula d’ADN, això provoca que les dues cadenes es separin. Si la solució d’ADN es deixa refredar les dues cadenes es tornen a unir, s’hibriden o renaturalitzen, gracies a la complementarietat de les seves bases.
A l’especificitat del reconeixement de les bases complementaries s’uneix la capacitat de l’ADN de replicar-se in vitro. Per a que tingui lloc la replicació es necessita un enzim, l’ADN-polimerasa, que catalitza la replicació afegint nucleòtids complementaris de la cadena motllo de l’ADN (cadena paterna) a l’extrem 3′ de la cadena nova (cadena filla). La replicació necessita a més a més un primer, és a dir un fragment d’ADN monocatenari que hibride amb l’extrem 3′ lliure de l’ADN de la cadena motllo, a partir del qual podrà començar a actuar l’ADN-polimerasa.
En una reacció bàsica de la PCR.
-
Dos primers que són complementaris de les regions dels dos costats del gen o seqüència d’ADN que es vol amplificar.
-
Una ADN-polimera específica, la Tq-polimerasa (obtinguda de l’espècie bacteriana Thermus aquaticus) que és termoestable i permet que tota la reacció transcorri en el mateix vial, sense necessitat d’afegir ADN-polimeras fresca, ja que no es desnaturalitza en augmentar la temperatura del vial.
Un cicle de la PCR consta de:
-
Desnaturalització de la doble helix d’ADN.
-
Hibridació amb la cadena de primers específics.
-
Elongació de les noves cadenes.
El nombre de cadenes obtingudes dintre del vial augmenta exponencialment en augmentar el nombre de cicles de la PCR, de manera que partint d’una sola cadena, en 30 cicles es poden obtenir fins a 10 elevat a 9 còpies de la cadena original.
AVANTATGES D’AQUESTA TÈCNICA
-
Ús fàcil.
-
Rapidesa.
-
Repetitivitat.
-
Sensibilitat.
-
És bastant econòmica i hi ha molt oferta al mercat.
LIMITACIONS D’AQUESTA TÈCNICA
-
Pèrdua d’eficàcia de la polimerització per formació de dímers de primers.
-
Desnaturalització de la Taq.
-
Contaminació d’ADN extern.
APLICACIONS DE LA PCR
-
Diagnosi de malalties infeccioses: detecció de l’ADN de l’agent infecciós en una mostra clínica.
-
Diagnosi de mutacions associades a malalties genètiques: detecció del gen anormal causant de la malaltia, ja sigui en adults o en anàlisi prenatal.
-
Anàlisi de seqüències d’ADN en mostres envellides com els restes fòssils. En aquest cas permet obtenir moltes còpies d’ADN molt escàs o molt degradat.
-
Medecina forense.
-
Clonació posterior.
-
Obtenció de sondes d’ADN.
-
Seqüenciació d’ADN.
-
Mutagènesi dirigida.
LA CANÇÓ DE LA PCR
Per tal de fer publicitat dels seus termorecicladors (aparells per la realització de la PCR) la empresa Bio-Rad, va editar un vídeo musical que us presento a continuació amb la lletra de la cançó.
[kml_flashembed movie="http://www.youtube.com/v/x5yPkxCLads" width="425" height="350" wmode="transparent" /]
The PCR Song
There was a time when to amplify DNA,
You had to grow tons and tons of tiny cells.
Then along came a guy named Dr. Kary Mullis,
Said you can amplify in vitro just as well.
Just mix your template with a buffer and some primers,
Nucleotides and polymerases, too.
Denaturing, annealing, and extending.
Well it’s amazing what heating and cooling and heating will do.
——PCR, when you need to detect mutations.
——PCR, when you need to recombine.
——PCR, when you need to find out who the daddy is.
——PCR, when you need to solve a crime.
——(repeat chorus)