Estudi-control d'aigües

-Es pesa en una balança 41,3 grams del medi en pols.
-En un vas de precipitats posem 1 litre d’aigua destil·lada i li afegim els 41,3 grams que em pesat anteriorment.
-Es posa el vas de precipitats en un Bunsen fins que arribi a l’ebullició.
-Posteriorment es posa en un Erlenmeyer i s’introdueix a l’autoclau.
-A l’autoclau estarà 15 minuts a 1 atmosfera.

-Es posa el medi líquid en les plaques de petri amb el nom del medi i la data del dia de la preparació.

-Un cop fred es guarda a la nevera

Aspergillus (http://www.unsa.edu.ar/matbib/hongos/04htextoaspergilos.pdf)

Morfologia

El color es la principal característica macroscòpica per a la seva identificació dels grups d’Aspergillus. Posseeixen diferents tonalitats de verd, groc, blanc, gris y negre.

Les característiques macro i micromorfològiques, com el color dels conidis, la forma del cap, la superfície i dimensions del condífor, la forma i textura de les espores, han permès agrupar els Aspergillus en seccions.

Identificació

Normalment es fa en base a les característiques macro i mocromorfologiques en diversos medis de cultius incubats a diverses temperatures amb la necessitat de conèixer en contaminant per orientar la recercar de micotoxines en un producte.

L’Aspergillus es característic ja que forma hifes gruixudes, normalment les seves ramificacions formen angles de 45º

Cultius

La majoria de les espècies creixen sobre Czapek-Levadura, però els Aspergillus (Aspergilli y Restricti) es desenvolupen sobre Czapek-20% Sacarosa. La ornamentació dels conidis canvia totalment amb la edat i en unes dos setmanes les espores estan totalment madures.

Per el seu aïllament s’utilitzen medis selectius (Rosa de Bengala, Rosa de Bengala-Diclorán) amb inhibidors de la proliferació bacteriana y del desenvolupament exuberant d’alguns mohos donant oportunitats a totes les espores d’originar una colònia.

Micotoxines

Són varis els metabòlits secundaris dels Aspergillus que són considerats micotoxines: aflatoxines, esterigmatocistina i altres; alguns dels quals també són produïts per espècies de penicilios, per exemple, àcid ciclopiazònic i ocratoxines.

Són molt abundants en quasi tots els hàbitats aquàtics. Morfològicament són organismes senzills, sense flagels, unicel·lulars o en forma de petites agrupacions de cèl·lules.

Presenten una gran diversitat (10.000 a 12.000 espècies diferents) i són els eucariotes més abundants del medi aquàtic.

Les diatomees són les fotosintetitzadores aquàtiques més importants, formen part del fitoplàncton sobretot predominen en aigües fredes i riques en nutrients.

Són molt importants en aigües antàrtiques on són consumides per el krill, aquest constitueix la base de la dieta de balenes, foques, pingüins i peixos.

El tret més distintiu de les diatomees és la seva paret cel·lular composada per sílice, anomenada frustul o teca.

La teca està formada per dues meitats desiguals:

– Epiteca → Part externa

– Hipoteca → Part encaixada per dins

La sílice és inert als atacs enzimàtics això fa que les diatomees siguin menys vulnerables a l’atac de microorganismes que altres algues, les parets de les quals que estan formades per polisacàrids.

Les diatomees alternen la reproducció asexual i la reproducció sexual.

Quan una diatomea es divideix per mitosi cada una de les meitats de la teca passa a una cèl·lula filla.

La paret heretada funciona com epiteca i cada cèl·lula genera una nova hipoteca. El resultat és que les cèl·lules de cada generació van sent cada cop més petites.

Per aquest motiu arriba un moment en que ja no es possible la divisió cel·lular per reproducció asexual, aleshores la diatomea passa a reproduir-se sexualment, restaurant així la mida original de les cèl·lules.

La tinció de Gram

La tinció de Gram és un tipus de tinció diferencial emprada en microbiologia per a la visualització de bacteris en preparacions microscòpiques. Deu el seu nom a Christian Gram, bacteriòleg danès que desenvolupà la tècnica el 1844. S’utilitza indistintament tant per a referir-se a la morfologia cel·lular bacteriana com també per al 1r pas en la diferenciació bacteriana, considerant-se bacteri Gram-positiu als bacteris que es visualitzen de color violeta i bacteri Gram-negatiu a les que es visualitzen de color rosa.

Protocol

Després de diluir el bacteri en una gota d’aigua i fixar-la amb calor lleu, s’han de seguir els següents passos seqüèncialment:

1. Fixar les cèl·lules amb calor

2. Afegir Blau Violeta (cristall violeta) i esperar 1 minut (Morats/Gram Positiu).

3. Esbandir amb aigua.

4. Afegir lugol i esperar 1 minut o 2

5. Esbandir amb aigua.

6. Afegir alcohol d’acetona.

7. Esbandir amb molta aigua.

8. Afegir safranina i esperar 20-30segons (Rosades/Gram Negatiu).

9. Esbandir amb aigua.

Explicació

El primer pas en qualsevol tinció ha de ser sempre la fixació amb calor. Després, en agregar el cristall violeta, aquest ingressa a totes les cèl·lules bacterianes, tant Gram positives com Gram negatives).

El Lugol està format per I2 (iode) en equilibri amb KI (iodur de potassi), el qual està present per a solubilitzar el iode. El I2 entra en les cèl·lules i forma un complex insoluble en solució aquosa amb el cristall violeta.

La mescla d’alcohol-acetona que s’agrega, serveix per a realitzar la decoloració, ja que en la mateixa és soluble el complex I2/cristall violeta. Els organismes Gram positius no es decoloren, mentre que els Gram-negatius si ho fan. Per a posar de manifest les cèl·lules Gram negatives s’utilitza una coloració de contrast. Habitualment és un colorant de color roig, com la safranina o la fucsina bàsica. Després de la coloració de contrast les cèl·lules Gram negatives es veuen roges, mentre que les Gram positives romanen blaves.

La safranina pot o no utilitzar-se, no és crucial per a la tècnica. Serveix per a fer un tinció de contrast que posa de manifest els bacteris Gram negatius. Al terme del protocol, els Gram-positius es veuran blau-violades i els Gram negatius, es veuran roses, si no s’ha fet tinció de contrast; o roges, si es va usar, per exemple, safranina.

Observacions

Sempre que es realitza el protocol, és fonamental realitzar el tractament amb cristall violeta abans de fer el tractament amb iode. El iode, en absència del cristall violeta, té poca afinitat per les cèl·lules, per la qual cosa es perd en els successius esbandits.

El procés de descoloració no ha de ser extens, i ha de respectar-se el protocol quant al temps designat per als mateix. Així mateix, ha d’utilitzar-se poca aigua per a evitar la pèrdua de tinció dels Gram negatius.

En treballar amb cultius de més de 24 hores, no es pot garantir la integritat de la paret cel·lular dels mateixos, i llavors el complex cristall violeta/iode pot no ser retingut.

Utilitats

En l’anàlisi de mostres clíniques sol ser un estudi fonamental per complir diverses funcions:

Identificació preliminar del bacteri causal de la infecció.

Utilitat com a control qualitat de l’aïllament bacterià. Els morfotips bacterians identificats en el tinció de Gram es deuen correspondre amb aïllaments bacterians realitzats en els cultius. Si s’observen nombre més gran de formes bacterianes que les aïllades cal reconsiderar els mitjans de cultius emprats així com l’atmosfera d’incubació.

A partir del tinció de Gram poden distingir-se diversos morfotipus diferents:

Els cocs són de forma esfèrica. Poden aparèixer aïllats després de la divisió cel·lular (micrococs), aparèixer per parells (diplococs), formar cadenes (estreptococs), o agrupar-se de manera irregular (estafilococs).

Els bacils posseeixen forma allargada. En general solen agrupar-se en forma de cadena (estreptobacils) o en palissada.

També poden distingir-se els espirals, que es classifiquen en:

Espirils si són de forma rígida

Espiroquetes si són blanes i ondulades.

Si al contrari, posseeixen forma de “coma”, o corbats, llavors se’ls designa vibrions.

Fonament teòric

La tècnica es basa en les diferències entre les parets cel·lulars dels bacteris Gram positius i Gram negatius.

La paret cel·lular dels bacteris Gram positius posseeix una gruixuda capa de peptidoglicà, a més de dues classes de àcids teicoics: Ancorat en la cara interna de la paret cel·lular i unit a la membrana plàsmatica, es troba l’àcid lipoteicoic, i més en la superfície, l’àcid teicoic que està ancorat només en el peptidoglicà, també conegut com mureïna.

Al contrari, la capa de peptidoglicà dels Gram negatiu és prima, i es troba unida a una segona membrana plàsmàtica exterior, de composició diferent de la interna, per mitjà de lipoproteïnes. Té una capa fina de peptidoglicà unida a una membrana exterior per lipoproteïnes. La membrana exterior és feta de proteïna, fosfolípids i lipopolisacàrids.

Per tant, ambdós tipus de bacteris es tinyen diferencialment a causa d’aquestes diferències constitutives de la seua paret. La clau és el peptidoglicà, ja que és el material que confereix la seua rigidesa a la paret cel·lular bacteriana, i els Gram positius el posseeixen en molta major proporció que els Gram negatius.

La diferència que s’observa en la resistència a la descoloració, se deu al fet que la membrana externa dels Gram negatius és soluble en dissolvent orgànic, com per exemple la mescla d’alcohol/acetona. La capa de peptidoglicà que posseeix és massa prima com per a poder retindre el complex de cristall violeta/iode que es va formar prèviament, i per tant aquest complex s’escapa, perdent-se la coloració blava. Però al contrari, els Gram positius, en posseir una paret cel·lular més resistent i amb major proporció de peptidoglicans, no són susceptibles a l’acció del solvent orgànic, sinó que aquest actua deshidratant els porus tancant-los, la qual cosa impedeix que puga escapar-se el complex cristall violeta/iode, i mantenint la coloració blava.

Els protozous

Són organismes animals microscòpics formats per una sola cèl · lula (unicel · lulars), heteròtrofs, que viuen en medis líquids, són capaços de moure i es reprodueixen per bipartició (la cèl · lula es divideix en dos). Alguns d’ells poden formar colònies.

Els protozous són els animals més senzills ja que estan formats per una sola cèl · lula i mitjançant aquesta única cèl · lula realitzen totes les funcions vitals.

Segons algunes classificacions, els protozous s’inclouen en el regne Protists, juntament amb altres organismes unicel · lulars els quals el nucli cel · lular està envoltat d’una membrana. Els protozous no tenen estructures internes especialitzades en forma d’òrgans o, si en tenen, estan molt poc diferenciades.

Entre els protozous se solen admetre diversos grups:

– Els Flagel · lats del grup dels Zoomastigins, amb moltes espècies que viuen com paràsits de plantes i d’animals.

Els protozous flagel · lats o Mastigòfors estan proveïts d’un o diversos flagels que els permeten moure.

Es reprodueixen per divisió longitudinal, viuen lliurement i molts són paràsits que produeixen malalties, algunes molt greus, especialment les tricomoniasis, la malaltia de la son, la malaltia de Chagas, la leptomoniasis, etc.

A la classe dels flagel · lats s’inclouen els fitoflagelats o dinoilagelats, que s’estudien en el Regne Vegetal (Algues unicel · lulars).

– Els ameboides del grup sarcodins, que inclouen als Foraminífers i Radiolaris, i que són components importants del plàncton.

– Els Ciliófors, que són ciliats, amb diversos representants que posseeixen estructures especialitzades que recorden a la boca i l’anus dels organismes superiors.

– Els Cnidosporidis, paràsits d’invertebrats, de peixos i d’alguns rèptils i amfibis.

– Els esporozous, amb diverses espècies paràsites d’animals i també d’éssers humans.

Són tots paràsits que no tenen òrgans locomotors i digestius.

Aquest tipus de reproducció cíclica origina algunes malalties greus, com les febres terciàries o paludisme

Habitants del món

Es coneixen més de cinquanta mil espècies de protozous, que inclouen organismes tan coneguts com els paramecis i les amebes, que poden viure aïllats o formant colònies.

Moltes espècies viuen en hàbitats aquàtics com oceans, llacs, rius i basses. La seva grandària varia des 2-70 micròmetres. Els protozous s’alimenten de bacteris, productes de rebuig d’altres organismes, algues i altres protozous.

Moltes espècies són capaços de moure utilitzant diversos mecanismes: flagels, estructures propulsores amb forma de fuet; cilis d’aspecte pilós, o per mitjà d’un moviment ameboide, un tipus de locomoció que implica la formació de pseudòpodes

Els protozous són molt abundants i es troben en tots els llocs de la terra, especialment, en els llocs humits. Són, sovint, paràsits sobre animals, plantes i sobre l’home, i poden produir malalties.

Respiració

La respiració la fan a través de la membrana cel · lular i per les partícules d’aigua absorbides amb l’aliment.

Quan el vacúol pulsatiu és plena d’aigua, s’obre i l’allibera a l’exterior.

Alimentació

L’alimentació dels protozous sol realitzar-se mitjançant la captura de l’aliment que penetra en el citoplasma a través d’una obertura de la membrana.

En el citoplasma es formen vacúols nutritius i els residus són expulsats per les vacúols fecals.

El parameci succiona l’aliment produint un remolí amb els cilis.

Les amebes atrapan l’aliment envoltant-lo amb els pseudópodes que formen.

Alguns protozous

Tripanosoma gambiensis

El tripanosoma és el causant de la malaltia de la son, i és transmesa per la mosca tsé-tsé.

Trichomonas

Causant de diverses malalties, a la boca, intestí, vagina. Altres tenen cirrus en forma de potes.

Viuen en aigües dolces o marines.

Alguns, com els ameboides, no tenen membrana rígida, altres, els foraminífers, radiolaris i heliozous posseeixen un esquelet silici o calcari i els seus pseudópodes són radiants d’infinitat de formes i dibuixos.

Existeixen en immenses quantitats en mars i rius, formant part important del plàncton.

Cicle del Paludisme

La femella del mosquit Anopheles pica a l’home i li inocula esporozoïts del Plasmodium.

Després, al fetge, es multipliquen en gran quantitat.

Seguidament envaeixen els glòbuls vermells de la sang.

Locomoció
Els protozous es mouen de diverses formes.

Classificació dels protozous segons la seva manera de desplaçar-se
Rizópodes: Posseeixen pseudópodes, que són prolongacions de la cèl · lula que serveixen per al moviment i per alimentar-se. Un exemple característic és l’ameba. També els foraminífers (amb una closca per els orificis surten els pseudòpodes) i la Entamoeba histolítica, que produeix la disenteria, malaltia pròpia dels països tropicals i que produeix unes diarrees molt intenses.

Ciliats: Es desplacen per cilis, filaments curts i nombrosos que envolten el seu cos. Poden tenir dos nuclis. Com a exemples podem citar el parameci i la vorticela.

Flagel · lats: Per moure utilitzen uns filaments llargs i poc nombrosos, anomenats flagels.
Molts són de vida lliure i altres són paràsits, com el Tripanosoma, que produeix la malaltia de la son.

El tripanosoma és transportat per la saliva de la mosca tse-tse, que s’encomana al picar a altres éssers vius.

Esporozous: Són tots paràsits de cèl · lules. No tenen òrgans de locomoció. Es reprodueixen per divisió múltiple, formant nombroses espores. Un representant és el plasmodi, que produeix la malària, també anomenada paludisme, és una malaltia dels glòbuls vermells de la sang. El plasmodi és transmès per la femella del mosquit Anopheles.

Enllaços d’interés:

http://lescienciesdelanaturadelllido.wordpress.com/2009/10/11/2-el-regne-protists-els-protozous-i-les-algues/

http://www.youtube.com/watch?v=fh_yjLppNAg&feature=related

http://www.youtube.com/watch?v=Zw4zPQZwG68&feature=related

CNIDOSPORIDIS (protozou)

Són paràsits de invertebrats, alguns peixos i també alguns rèptils i amfibis. No tenen flagels i els seus cicles biològics tenen poques coses en comú amb els de les Gregarines i Coccidis, amb els que se’ls sol situar. A més els tres grups principals de Cnidosporidis (mixosporidis, Actinomixidis i Microsporidis) poden no estar emparentats.

Una de les característiques unificadores dels tres es la anomenada “espora”. Però les espores dels Mixosporidis, Actinomixidis i Microsporidis tenen orígens diferents a les espores de les plantes. Són quists o cistos que comprenen un o més cossos infectats, a vegades, poden originar una nova generació.

–         Mixosporidis –> Ordre d’esporozou que es caracteritzen per les espores que presenten, de formes i mides variades, amb membranes de 2, 4 o 6 valves i 1, 2, 3 o 4 corpuscles polars. La majoria són paràsits de peixos, encara que uns quants ho són d’amfibis i rèptils. Les espores d’aquests normalment consten de dues valves que comprenen càpsules polars i un cos infectant ameboide (esporoplasma).

–         Actinomixidis –> Ordre de protozous esporozous integrat per individus paràsits d’hostes marins, amb espores d’estructura complexa formades per tres valves.

–         Microsporidis –> Ordre de protozous de la classe dels esporozous de mida molt petita (3-6 μ) i caracteritzats pel fet de tenir una sola càpsula polar a l’espora. Les espores són ovals, ovoides o piriformes. Generalment parasiten les cèl·lules intestinals d’invertebrats. L’espècie Nosema bombycis, per exemple, ataca els cucs de seda, als quals produeix la pebrina.

ESPOROZOUS (protozou)

Són tots els paràsits que no tenen òrgans locomotors i digestius. Aquest tipus de reproducció clínica origina algunes malalties greus com les febres terciaris o el paludisme.

Ordinàriament tenen dos hostes, un dels quals és l’intermediari i l’altre el definitiu. Sovint l’home és un d’aquests hostes. Podem distingir tres grans grups amb la categoria de subclasse, els neosporidis, els sarcosporidis i els telosporidis.

–         Neosporidis: Subclasse d’esporozous que es diferencia de l’altra subclasse (telosporidis) en el fet que els individus no tenen un cicle previ àgam, sinó que la reproducció sexual té lloc ràpidament i tot seguit es formen les espores. Aquestes són tan complexes, que semblen metazous, i presenten com a característica les càpsules polars, amb un líquid urticant i unes valves plasmodials. Típicament tenen un sol hoste.

–         Sarcosporidis : de característiques semblants a les dels neosporidis, però sense càpsules polars, són també ameboides. Alguns viuen paràsits als músculs i teixits conjuntius de certs vertebrats (mamífers, ocells i rèptils) i invertebrats aquàtics (anèl·lids, etc). De vegades llurs quists allargats formen grups que en madurar contenen espores falciformes. Secreten una substància tòxica, la sarcocistina. Són causants d’importants lesions musculars.

–         Telosporidis: Subclasse d’esporozous integrada per individus amb un cicle previ àgam (esquizogònia), que presenten alternança de generacions, llevat d’algunes gregarines, de manera que l’esquizogònia alterna amb l’esporogònia. Comprèn els ordres dels coccidis i de les gregarines

S’utilitza per comprovar la presència de l’enzim catalasa que es troba el la majoria dels bacteris aerobias i anaeròbies facultatives que contenen citocrom. La principal excepció és Streptococcus.

Originàriament, aquesta prova era utilitzada per diferenciar entre els següents gèneres:

*Streptococcus (-) de *Micrococcus (+) i/o *Staphylococcus (+).
*Bacillus (+) de *Clostridium (-).
*Lysteria *monocytogenes (+) i/o *Corynebacterium (+, amb les excepcions de C.*pyogenes i C.*haemolyticum, tots dos -) de *Erysipelothrix (-)
Una prova de rutina de la catalasa a temperatura ambienti pot fer-se seguint dues tècniques:

Mètode del portaobjectes (recomanat):
Amb el rosteix de sembra recollir el centre d’una colònia pura de 18-24 hores i col·locar sobre un portaobjectes net de vidre.
Agregar amb degotador o pipeta *Pasteur una gota d’H2O2 al 30% sobre el microorganisme sense barrejar-ho amb el cultiu.
Observar la formació immediata de bombolles (resultat positiu).
Rebutjar el portaobjectes en un recipient amb desinfectant.
Si s’inverteix l’ordre del mètode (estendre la colònia sobre l’aigua oxigenada) poden produir-se falsos positius.

Mètode del tub d’assaig:
Agregar 1ml d’H2O2 al 3% directament a un cultiu pur de *agar en *slant densament inoculat.
Observar la formació immediata de bombolles (resultat positiu).
Precaucions: Si s’utilitzen per a aquesta prova cultius procedents de *agar sang, s’ha de tenir la precaució de no retirar una mica de *agar amb el rosteix en retirar la colònia ja que els eritròcits del mitjà contenen catalasa i la seva presència donarà un fals resultat positiu.

http://www.tgw1916.net/video_pages/catalase.html

Per la determinació d’anaerobis s’utilitzen els següents tipus de medis de cultiu:

• Medi Tioglicolat
• Agar Sang
• Agar Xocolata
• Bilis-Escolina

A més es poden utilitzar altres proves com:

• Sensibilitat al oxigen
• Morfologia de les colònies
• Invasivitat
• Pigment d’hemòlisi
• Movilitat, medi MIO
• Catalasa
• Indol
• Hidròlisi de midó
• Reducció de nitrats
• Fermentació de carbohidrats
• Sensibilitat/Resistència a antibiòtics (penicilina, rifampicina,…)

S’utilitzen medis com:

• Agar sang en condicions anaeròbiques
• Agar sang PEA
• Agar Schaedler
• Sulfite Polymyxin sulfadiazine Agar
• Plate Count Agar

http://www.tgw1916.net/video_pages/Clostridii_apa.html