Estudi-control d'aigües

Els estreptococs són un grup de bacteris en forma de cocs Gram + agrupats en cadenes de dos o més. Són immòbils i no formen espores.
Des del punt de vista bioquímic són: microaeròfils o anaerobis facultatius, exigents en el medi de cultiu, no són afectats per la bilis, fermenten sucres sense produir gas, catalasa -, oxidasa -.

SISTEMÀTICA
Sistemàticament és un grup molt complex que es classifica per les seves característiques immunològiques i les seves propietats hemolítiques.
Des del punt de vista de la seva importància respecte dels aliments es poden dividir en quatre grups:
grup piogènic (formadors de pus). Inclou espècies patògenes com S. agalactiae (mastitis de les vaques), S. pyogenes (faringitis, escarlatina …). Aquest grup no creix a 10 ºC ni a 40 ºC.
grup viridans. Inclou S. thermophilus present en el iogurt i en alguns formatges, S. bovis present en el tracte digestiu de les vaques i en els femers. Aquest grup pot créixer a 45 ºC però no ho fan a 10 ºC.
grup làctic. Inclou S. lactis i S. cremoris que actuen com a ferments en formatge, iogurt i mantega. Aquest grup no pot créixer en medis amb més d’un 4% de sal.
grup enterococs. Inclou S. faecalis (present en l’intestí humà) i S. faecium (present en vegetals). Aquest grup creix a 10 oC , 45 oC i també en medis amb un 6.5% de sal. Aquest grup pot suportar temperatures altes (pot resistir la pasteurització).
Els estreptococs són molt resistents a les condicions ambientals adverses (congelació, dessecació, escalfament, …). Per aquesta raó, són utilitzats com a indicadors de contaminació fecal i com a indicadors de tractament i/o conservació inadequada dels aliments.
Les tècniques microbiològiques aplicables a la indústria alimentària pretenen posar de manifest la presència de estreptococs d’origen fecal (també anomenats enterococs). Aquests estreptococs d’origen fecal són S. faecalis, S. faecium, S. durans, S. bovis i S. Equinum.

TÈCNIQUES ANALÍTIQUES (ESTREPTOMETRIA)
El mètode oficial de determinació de la presència d’estreptococs fecals en aigua (Ordre nº 21936 del 27/7/83) consisteix en un primer cultiu de la mostra problema en un medi d’enriquiment per a estreptococs (brou de Rothe) i una posterior confirmació en un altre medi selectiu (brou de Litsky). Les mostres que donin creixement en el segon medi es consideraran com a estreptococs d’origen fecal.
La determinació de la quantitat de bacteris presents s’aconsegueix pel mètode del Nombre Més Probable (NMP) mitjançant la utilització de taules adients al cas. La quantitat de mostra sembrada i la concentració del medi de Rothe utilitzat en la prova presumptiva depèn de la taula del NMP seleccionada.
La mateixa ordre defineix un mètode alternatiu per filtre de membrana que consisteix en filtrar un volum conegut d’aigua problema a través d’un filtre d’èsters de cel•lulosa, i incubar el filtre sobre agar glucosa fosfat azida trifenil tetrazoil Agar Slanetz i Bartley (SB) a 37±1 ºC durant 48 ± 3 h.
La ICMSF recomana per fer el recompte dels enterococs presents en els aliments la realització d’un banc de dilucions a partir de la suspensió mare o de la mostra, la sembra per inclusió en dues plaques per dilució amb agar Kerner Fecal (KF) o bé Agar Parcker 80 (AP 80), la incubació durant 48h (72 h) a 35-37 ºC. Al finalitzar aquest temps cal fer el recompte de les colònies típiques.

Grups de practiques

• Grup 1: Alba Ballesteros, Alessandro Castro i Alejandro Yagüe
• Grup 2: Noemí Riera, Mirta Roca i Mònica Morell
• Grup 3: Ashley Manzano, Davinia Bermúdez i Carlos Barea
• Grup 4: Laura Ars, Marga de la Blanca, Marian Rosa i Laura Bustos
• Grup 5: Sara Rodríguez, Sandra Cabada i Núria Patiño

Aigües potables

• Font de Cerdanyola Nº1: grup 4
• Font Creteil Nº2: grup 1
• Parc Rocafonda Nº3: grup 2
• Av. Amèrica Nº4: grup 2
• Font del pericó Nº5: grup 4 i 5
• Font del barri Nº6: grup 3
• Font plaça Rocafonda Nº7: grup 5

Aigües no potables

• C.A Laietana Nº8: grup 1 i 5
• Mujer del lago Nº9: grup 2
• Blanes Nº10: grup 3

Bases

• Laura Nº11: grup 1 i 4
• Davinia Nº12: grup 3

Aigües freta

• Primer pis: grup 4
  • Noies
  • Nois
• Segon pis: grup 1
  • Noies
  • Nois
• Tercer pis:
  • Noies: grup 2
  • Nois: grup 3

• Quart pis: grup 5
  • Noies
  • Nois
• Pati: grup 2
  • Noies
  • Nois

Classificació dels medis de cultius:

• Generals. El més característic és l’agar glucosat de Sabouraud (AGS). S’utilitza com a medi de cultiu general i fonamentalment per realitzar la descripció morfològica característica de les colònies.
• Enriquits. S’utilitzen, especialment, en micosis sistèmiques endèmiques i per la recuperació de la fase levaduriforme. Ejemple: agar cervell-cor amb sang (BHI).
• Selectius: són medis que favoreixen el creixement dels microorganismes desitjats impedint els altres. Els components més utilitzats com agents selectius són antibacterians com el cloranfenicol, gentamicina, penicilina i estreptomicina; i també inhibidors de fongs com la cicloheximida.
• Diferencials. S’utilitzen per ajudar a la identificació del fong basat en la aparença d’aquest medi per l’addició de determinats components com, per exemple, substàncies cromògenes o indicadors de pH com el DTM.
• Especialitzats. Són medis que contenen algun component destinat aïllar a un agent concret, afavorir la identificació de certes espècies. Per exemple, agar acetat, agar patata-pastanaga.

Exemples:

• Agar Czapek Dox. S’utilitza pel cultiu de fongs sapròfits, especialment Aspergillus spp i Penicillium spp. És un medi de referència per la identificació d’Aspergillus spp.
• Agar CAN. Específic pel cultiu de l’espècie Candida.
• Agar de patata glucosa (APG). És un medi utilitzat per l’estimulació de la formació de conidies, en la preparació d’inòculs de fongs micelials i en l’estimulació de producció de pigments vermells. S’utilitza amb freqüència en microcultius per observar les característiques morfològiques.
• Agar de Staib. Agar “semillas de niger” (Guizottia abyssinica). Utilitzar per aïllar Cryptococcus spp i C. Neoformans. Aquest últim és l’únic que posseeix fenol oxidasa que el permet formar un pigment similar a la melanina a partir de l’àcid cafeico, un catecol que posseix la llavor. El cloranfenicol el converteix en un medi selectiu. Existeixen medis semisintètics que incorporen l’àcid cafeico i eviten la utilització de la llavor.
• Agar Dixon modificat. Utilitzat en el cultiu de Malassezia spp. Pot modificar-se afegint cloramfenicol o bé cloramfenicol i cicloheximida.
• Agar glucosat de Sabouraud modificat per Emmons. És el medi d’estàndard per l’aïllament, esporulació i conservació de molts fongs. El seu pH i la concentració de glucosa  afavoreixen l’esporulació.
• Agar infusió de cervell-cor. Poden utilitzar-se com medis enriquits per facilitar el creixement de C. Neoformans a partir de mostres estèrils com el LCR, amb sang o sense ella. En general, està indicat per l’aïllament d’una gran varietat de patògens, incloent llevats, fongs i bactèries com Nocardia. Enriquit amb sang, s’utilitza per l’aïllament de tots els fongs, incloent els dimòrfics. Poden afegir-se antibacteriants per convertir-lo en selectiu. En algunes ocasions també poden completar-se amb cicloheximida.
• Agar inhibidor de fongs. És un medi enriquit que conté cloramfenicol o gentamicina, però no actidiona. S’utilitza en l’aïllament de fongs sensibles a la cicloheximida, com el Cryptococcus, Zigomicets,etc, a partir de mostres contaminades. Permet el desenvolupament de la majoria de fongs i llevats.
• Agar Leeming i Notman (ALN). Utilitzat en el cultiu de Malassezia spp. Pot modificar-se afegint cloramfenicol o bé cloramfenicol i cicloheximida.
• Agar Sabouraud amb Cicloheximida i Cloramfenicol. És un medi selectiu utilitzat per l’aïllament de fongs patògens a partir de mostres molt contaminades amb fongs sapròfits i bactèries. S’utilitza fundamentalment en l’aïllament de dermatòfits i fongs dimòrfics. Inhibeix algunes espècies de fongs d’interès mèdics (Candida no Albicans, Aspergillus, Zigomicets, C. Neoformans, etc)
• Agar Trichophyton. Són set medis que s’utilitzen en la identificació d’espècies de Trichophyton basant-se en els seus requeriments nutricionals.
• Agar urea de Christensen. S’utilitza en la identificació d’alguns dermatòfits, especialment Trichophyton rubrum de Trichophyton mentagrophytes i d’alguns llevats (C. Neoformans).
• Medis cromogènics per llevats. Conté diversos substrats enzimàtics que estan units a compostos cromogènics. Molt útil per l’estudi de llevats.
• Dermatophyte test medium. Medi utitlitzar per l’aïllament de dermatòfits en mostres molt contaminades, proporcionant una identificació presuntiva. Els dermatòfits produeixen alcalinització, virant el medi de groc a vermell. Algunes bactèries i alguns fongs també poden produir alcalinització. Degut a que es tracta d’un medi colorejat, no és un medi útil per la caracterització dels pigment produïts pels dermatòfits. La cicloheximida inhibeix molts dels fongs sapròfits.

• Pesem en una balança 36 grams del medi E:M.B en pols.
• Posteriorment col·loquem en un vas de precipitat 1 litre d’aigua destil·lada, en els quals afegim els 36 grams que em pesat anteriorment.
• Barregem bé la preparació.
• Posem el vas de precipitats amb la preparació en un Bunsen fins que arribi a l’ebullició i es manté durant 1 minut.
• Un cop passat el minut es posa la preparació en un Erlenmeyer i s’introdueix en l’autoclau estarà 20 minuts a 1 atmosfera.
• Posteriorment posem el medi líquid en les plaques de petri amb el nom del medi i la data del dia de la preparació.
• Un cop realitzat aixo i les plaques estan fredes es col·loquem en la nevera.

Shigelle és un bacil gran negatiu que pertany a la família d’Enterobacteriaceae. Es caracteritza per no fermentar la lactosa, ser immòbil i no produir lisina; catalasa positives i oxidasa negatives. S’identifica per les característiques bioquímiques i antigèniques.

A nivell de microbiologia es sembra mostra en medis:

• Agar McConkey. Shigella no fermenta la lactosa, per tant, s’observen colònies transparents.
• Agar EMB. Colònies transparents
• Agar MIO. Motilitat negativa
• Agar TSI, per observar la fermentació de diferents sucres, la producció de gas (negatiu per shigella) i la producció d’àcid.
• Agar urea
• Phenilanine Agar

Regnum Prokaryotae

Característiques

És un bacil gram negatiu, catalasa positiu i oxidasa negatiu, que fermenta la glucosa i la lactosa. Gram negatives, bacils rectes, anaerobis facultatius, mòbils (flagels) o no mòbils i no formadores d’espores. Les colònies en agar nutrients pot ser convexa llisa, baixa, superfície brillant, vora sencera, gris, tipus R o formes mucoide pot passar.

Determinacions

• MacConkey:
  • Positiu: hi ha una hidròlisi de la lactosa produint àcids orgànics fent que el color de la placa es torni vermell/rosa.
• Catalasa:
  • Positiu: presència de bombolles
• PHE:
  • Negatiu: no hi ha cap reacció.
• MIO:
  • mobilitat + (-)
  • indol: + (-)
  • ornitina: +/-
• LIA:
  • K/K(A)
  • SH2 –
  • Lisina + (-)
• TSI:
  • A(K)/A
  • Gas + (-)
  • SH2 –
• Urea:
  • Negatiu: no presenta canvis
• Citrat:
  • Negatiu: romana de color verd

Listeria monocytogenes és un BGP, no ramificat i anaerobi facultatiu. És catalasa positiu, no presenta càpsules ni espores. Té flagels, és mòbil als ≤30ºC, però immòbil a 37ºC ja que els flagels s’inactiven.

Es realitzen sembres en:

• Agar Sang. Colònies grisoses amb β-hemòlisi.
• Bilis-Escolina, perquè hidrolitza la escolina i la glucosa en presència de sals biliars, provocant una coloració negra.
• Voges-Proskauer. Genera àcid a partir de la glucosa i produeix acetoïna. No fermenta la xilosa.
• Medi MIO
• Prova de CAMP. Consisteix en sembrar en agar sang una estria en forma horitzontal de Listeria i una perpendicular a aquesta de S. Aureus sense que s’uneixen entre si. El resultat serà que Listeria generi el factor CAMP el qual produeix un sinergisme amb la beta lisina produïda per S. Aureus sobre els hematies generant una lisi d’aquestes.

-Es pesa en una balança 36 grams del medi en pols.
-En un vas de precipitats posem 1 litre d’aigua destil·lada i li afegim els 36 grams que em pesat anteriorment.
-Es posa el vas de precipitats en un Bunsen fins que arribi a l’ebullició i es manté en ebullició 1 minut.
-Posteriorment es posa en un Erlenmeyer i s’introdueix a l’autoclau-
-A l’autoclau estarà 15 minuts a 1 atmosfera.

-Es posa el medi líquid en les plaques de petri amb el nom del medi i la data del dia de la preparació.

-Un cop fred es guarda a la nevera.

Antibiograma

L’antibiograma es l’estudi de la sensibilitat “in vitro” de les bactèries a els antibiòtics, la raó per la qual es realitza l’estudi de un antibiograma de un microorganisme determinat, radica en el fet de la sensibilitat als antibiòtics de les diferents especies de microorganismes, i en el fet que en moltes especies existeixen diferencies de sensibilitat a un determinat antibiòtic entre diferents soques.

Un cop s’ha realitzat un antibiograma es capaç de donar la següent informació:

• Grau de sensibilitat de les colònies bacterianes a un antibiòtic específic.
• Diferencia de la sensibilitat per part de les colònies a diferents antibiòtics.

Amb aquesta informació es califica el efecte que exerceix l’antibiòtic damunt de una determinada colònia de microorganismes com:

• Resistent (R)
• Intermitg  (I)
• Sensible (S)

L’evolució d’aquesta sensibilitat ens ajuda en la selecció del antibiòtic mes adequat per el tractament de una infecció bacteriana. Les probes mes utilitzades per avaluar la sensibilitat de una bacterià a un agent antibacterià estan basades en la refrigeració “in vitro” de la bacterià amb diferents concentracions de l’agent.

• Concentració mínima inhibitòria (CMI): es defineix com la menor concentració de antibiòtic capaç de inhibir el desenvolupament de una soca de microorganisme.
• Concentració mínima bactericida (CMB): es defineix com la menor concentració de antibiòtic capaç de destruir una soca microbiològica.

Mètodes de antibiograma basats en la difusió.

Material.

• Bacteri a analitzar
• Plaques de petri amb el medi de cultiu idoni.
• Pinces
• Discs d’antibiòtics que es volen emplear
• Nanses
• Solució salina
• tub

Tècnica.

• El primer pas es preparar l’inòcul, partint de un cultiu pur, s’ha de agafar amb la nansa de sembra una o mes colònies del microorganisme que volem analitzar, i l’introduïm amb un tub que a de contenir la solució salina (aquet inòcul ha de equivaler al estàndard  0.5 de la escala de McFarland).
• S’ha de inocular la superfície de la placa de petri amb agar amb una nansa o un hisop, passant-lo uniformement per tota la superfície, esparar  minuts
• Després es col·locaran els discos de antibiòtics sobre la superfície de l’agar inoculat, amb unes pinces estèrils, els discos han de tenir una separació de 15 mm dels costats de la placa i han de estar separats entre ells, s’ha de deixar la placa 15 minuts a temperatura ambient perquè es comencin a difondre els antibiòtics .
• S’incuba la placa a 37ºC durant 18/24hores.
• Un cop a passat el temps de incubació, es mesuren els diàmetres dels halos i s’interpreta els resultats obtinguts.

Resultats.

El diàmetre dels halos es tradueixen en diferents categories:

• Sensible
• Intermitj
• Resistent

Mètodes de antibiograma basats en la dilució.

Material.

• Nansa
• Medi de cultiu
• Tubs
• Antibiòtics

Tècnica.

• El primer que hem de fer es realitzar una dissolució amb el microorganisme que es vol analitzar (les dissolucions generalment so 1:2) en tubs amb medi i que contenen diferent concentracions de antibiotic.
• Després de la incubació del microorganisme l’hem de incubar durant 24hores.
• En els tubs s’han de observar la turbidessa dels tubs que indicarà el desenvolupament de el bacteri.
• El bacteri ha de créixer en el tub control i en els altres que no continguin el suficient agent antimicrobià com per inhibir el desenvolupament.
• La concentració de antibiòtic que presenti absència de creixement, es detecta per la falta de turbidessa, que es designarà com la concentració mínima inhibitòria (CMI).
• Es diu que la CMI correspon a el tub de concentració mes baixa, que aconsegueixi inhibir el 90% del creixement bacterià.

Sistemas automatitzats.

Son mètodes completament automàtics, tant com la inoculació, la incubació i la lectura dels resultats. aquets mètodes es basen en la microdilució.

El gènere Salmonella són enterobacteris de bacils gram negatiu, anaerobis facultatius. Que es caracteritzen per ser catalasa positiu i oxidasa negatiu amb la producció d’àcid (H₂S).

Per la seva identificació es poden realitzar sembres en:

• Agar Xilosa- Lisina-Desoxicolat (XLD) on apareixen colònies roses o vermelles que poden ser transparents amb el centre negre o no. En certs casos, també poden aparèixer colònies completament negres.
• Agar salmonella-shigellan (SS). Colònies translúcides, en ocasions opaques. Algunes poden tenir el centre negre.
• Agar McConkey. Colònies blanquinoses o sense color.
• Agar Mueller-Hinton
• Triple Sugar Iron Agar (TSI), per observar la fermentació o no de sucres, la producció d’àcid i de gas, les quals serviran per diferenciar les subespècies de Salmonella.
• Agar MIO i LIA. Per realitzar la mobilitat, d’indol i la ornitina.

Enllaç directe a l’enciclopèdia “Regnum Prokaryote“: